El año de nacimiento más probable es 1540, en Fontiveros (Ávila, España). Se queda muy pronto huérfano de padre y debe trasladarse con su madre de un lugar a otro, mientras sacaba adelante como podía sus estudios, y procuraba ganarse la vida. En Medina, en 1563, vistió el hábito de los Carmelitas y después del año de noviciado obtuvo licencia de vivir según la Regla sin mitigaciones.
Ordenado sacerdote en 1567, después de los estudios de filosofía y teología cursados en Salamanca, el mismo año se encontró con Santa Teresa de Jesús, que hacía poco había obtenido del Prior General Rossi licencia para la fundación de dos conventos de frailes carmelitas contemplativos (después llamados Descalzos), para que fuesen de ayuda a las monjas por ella fundadas. Un año después - durante el cual se puso de acuerdo con la Santa - el 28 de noviembre de 1568 forma parte del primer núcleo de reformados en Duruelo, cambiando el nombre de Juan de San Matías por el de Juan de la Cruz.
Varias fueron las funciones desempeñadas por él en la reforma. De 1572 a 1577 fue también confesor-gobernador del monasterio de la Encarnación de Ávila (no de la reforma, donde había sido priora Santa Teresa, al principio). En calidad de tal se encontró envuelto en un desagradable incidente de la vida interna del monasterio del cual fue considerado en cierta forma responsable: preso, permanece aproximádamente ocho meses en la cárcel del convento de Toledo, de donde huyó en agosto de 1578; en la cárcel escribió muchas de sus poesías, que más tarde comentó en sus célebres obras.
Después del acontecimiento de Toledo, ejerció de nuevo varias funciones de superior, hasta que el Vicario General (mientras tanto la reforma había obtenido una cierta autonomía) Nicolás Doria lo dejó de lado en 1591. Y no fue ésta la única "prueba", en los últimos tiempos de su vida, para el que había dado todo a la reforma: soportó todo como saben hacerlo los santos. Murió entre el 13 y el 14 de diciembre de 1591 en Úbeda; tenía 49 años.
Su magisterio fue fundamentalmente oral; si escribió, fue porque insistentemente se lo requirieron. Tema central de su enseñanza que lo ha hecho célebre dentro y fuera de la Iglesia Católica es la unión por la gracia del hombre con Dios, por medio de Jesucristo: del grado más humilde al más sublime, en un itinerario que prevé las etapas de la vida purgativa, iluminativa y unitiva, en otras palabras, de los principiantes, proficientes y perfectos. Para llegar al todo, que es Dios, es preciso que el hombre dé todo de sí, no con espíritu de esclavo, sino de amor. Son célebres sus aforismos: "Al atardecer de la vida serás juzgado sobre el amor" y "donde no hay amor pon amor y encontrarás amor". Canonizado por Benedicto XIII el 27 de diciembre de 1726, fue proclamado Doctor de la Iglesia por Pío XI el 24 de agosto de 1926.